肌腱损伤可能会导致两大弊端。与周围组织粘连可能会限制活动范围，而纤维血管瘢痕形成则会导致不良的生物力学结果。修复装置可能有助于缓解这些问题。乳液静电纺丝技术被用于开发一种基于聚合物 DegraPol（DP）的新型三层管，中间层掺入了胰岛素样生长因子 - 1（IGF-1）。扫描电子显微镜被用于评估含 IGF-1 的纯 DP 网的纤维直径。研究人员还通过傅里叶变换红外光谱、差示扫描量热法、水接触角测量，以及通过 ELISA 评估机械性能和释放动力学，并用兔跟腱肌腱细胞中 I 型胶原、ki67 和腱调蛋白的 qPCR 来评估 IGF-1 的生物活性，进行了进一步表征。含 IGF-1 的管可将生长因子持续释放长达 4 天，并通过显著上调 ki67 和腱调蛋白基因表达显示出生物活性。此外，它们在机械性能上被证明优于纯 DP 管（断裂应变、破坏应力和弹性模量显著更高）。这种新型三层管旨在用于断裂后常规缝合的肌腱上，可能有助于加速愈合过程。IGF-1 的释放可刺激修复部位细胞的增殖和基质合成。此外，由于物理屏障的存在，可减少与周围组织的粘连形成。
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️ 一、引言
在过去几十年中，肌腱断裂修复技术已取得许多进展。用于跟腱修复的最常见外科手术要么是微创手术，要么包括经皮技术。尽管如此，优化方法仍然受到欢迎，因为通常长达 3 至 6 个月的缓慢愈合过程往往无法实现完全的功能恢复和力量恢复。正在愈合的肌腱在生物力学上的劣势需要修复装置或其他外部信号的支持，以帮助加速组织再生。
在不同的策略中，生长因子已被广泛研究用于支持肌腱愈合。例如，血小板衍生生长因子 - BB（PDGF-BB）是一种有前景的候选因子，有研究报道其可改善完全横断并缝合的兔跟腱术后三周的生物力学结果。转化生长因子 -β（TGF-β）作为肌腱愈合过程中的另一种重要生长因子，据报道具有有利影响，尤其是在与骨骼的界面处应用时。此外，胰岛素样生长因子 1（IGF-1）最近在啮齿动物模型的跟腱缺损愈合中受到关注，其中黏土纳米颗粒吸附 IGF-1 并组装成微颗粒，物理捕获在水凝胶网络中，提供该生长因子的缓慢稳定释放。
生长因子 IGF-1 是一种通过肝脏中生长激素（GH）刺激产生的蛋白质。已知它可调节骨骼肌中的合成代谢和分解代谢途径，辅助衰老过程（与 GH 共同作用），并在针对肌腱组织工程的细胞培养中与 PDGF-BB 协同作用。此外，多项在肌腱愈合中使用 IGF-1 的方法已取得成功，例如实现大鼠跟腱或大鼠肩袖肌腱的早期功能恢复，在 IGF-1 治疗的马屈肌腱炎中导致更高的细胞增殖和胶原蛋白含量，或在兔髌腱中与 TGF-β 联合增加肌腱生物力学性能。此外，最近有研究报道，植物雌激素通过激活 IGF1R（IGF-1 受体）和 MAPK 信号传导，支持大鼠跟腱模型中的肌腱愈合，证明了这些信号级联的积极作用，这些级联也通过 IGF-1 与 IGF1R 的结合而激活。
考虑到这些方面，我们开发了一种具有 IGF-1 持续释放功能的静电纺弹性三层聚合物管，设想用于缝合的肌腱断裂处。该装置的制造基于我们之前的研究，其中我们开发了一种具有 PDGF-BB 持续释放功能的生物活性双层管。与 24.3 kDa 的蛋白质 PDGF-BB 相比，7.6 kDa 的 IGF-1 体积较小，因此必须首先通过设计多层管来优化释放动力学，其中三层的中间层包含生物活性成分，而两个外层仅由聚合物 DegraPol（DP）组成。
在这里，我们介绍这种含 IGF-1 的修复装置的开发和制造，以及深入表征，包括扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热法（DSC）、水接触角和生物力学分析。本研究的目的是优化 IGF-1 释放动力学作为蛋白质载体血清白蛋白浓度的函数，并通过 qPCR 验证释放的 IGF-1 因子在补充到兔跟腱肌腱细胞培养物中的生物活性。由于有报道称 IGF-1 可以在 - 80°C 下于 20% 血清中储存超过 7 个月，我们确定了在 - 20°C 和室温下长期储存条件（10 个月）对新型植入物释放动力学的影响，旨在为这种现成医疗装置进入潜在的未来临床环境铺平道路。
️ 二、结果
️01. 扫描电子显微镜和纤维厚度
当比较内外表面时，典型的静电纺管显示出不同的表面结构（图 1）。面向金属棒的内表面光滑，而外表面呈现沟槽状结构。
图1. 纯管和含 IGF-1 管的扫描电子显微镜图像。乳液静电纺管的外表面显示沟槽（红色箭头，（A））；乳液静电纺管的内表面表面相当光滑（无沟槽，（B））；乳液静电纺管的横截面显示外表面的沟槽（红色箭头）和内表面光滑但仍多孔的结构，该内表面在先前的静电纺丝过程中面向扁平金属目标（蓝色箭头，（C））。
对于体内预期用途，此类管将被翻转，使沟槽状结构面向修复的肌腱，由于带槽侧的滑动摩擦系数较高，这使得管更好地固定在位。
纯的和乳液静电纺管（在油包水乳液中含有 IGF-1）的纤维厚度差异不大，平均约为 5 µm（图 2）。虽然在 DP 和 IGF-1 管的内表面，纤维厚度没有显著差异，但在外表面（带沟槽），乳液静电纺管的纤维厚度明显低于纯 DP 管。
图2. 纯 DP 网和含 IGF-1 的乳液静电纺管（DP-IGF1）的静电纺网纤维厚度。对于所有含有 IGF-1 的管，无论是在中间层还是在外表面，内表面始终由纯 DP 组成。管数 n=3。对每个表面进行非参数 Kruskal-Wallis 检验以确定中位数差异的显著性。数据以包含四分位距和 95% 置信区间的箱线图显示。p 值≤0.05 被认为显著，用 p≤0.001（*）表示；p≤0.0001（**），以及非显著（ns）。用于评估直径的纤维数量；内表面 DP n=48 和 DP-IGF-1 n=141；外表面 DP n=65 和 DP-IGF-1 n=167，分别。
️02. 机械性能
由于材料固有的各向异性（沟槽），纯 DP 管和 IGF-1 管的机械性能在横向和轴向均进行了评估。横向的生物力学通过两种不同方式评估：一次作为环形件（封闭管），一次作为条带（打开管）（图 3A）。含 IGF-1 的管的极限拉伸应力和杨氏弹性模量显著高于纯 DP 管（图 3B，C）。IGF-1 乳液静电纺管在轴向表现出显著更高的断裂应变（图 3D）。为了评估材料的各向异性，分别比较了每种管在轴向和横向之间的极限拉伸应力差异（图 3E）。
图3. 静电纺管的机械性能。切割样品以评估横向和轴向机械性能的示意图（A）；极限拉伸应力（B）；杨氏模量（C）；断裂应变（D）；分别为 IGF-1（一层）和纯 DP 管的杨氏模量（E）。数据以平均值和标准差显示，并带有单个值。n=6。机械性能通过 Kruskal-Wallis 检验进行比较，p 值≤0.05 被认为显著，用（）表示；p≤0.001（**）；以及非显著（ns）。
️03. 傅里叶变换红外光谱和差示扫描量热法
分别对四个含 IGF-1 的 DP 管、四个纯 DP 管和 DP 粉末进行了 FTIR 光谱分析（图 4）。为了比较，评估了聚乙二醇（PEG）的光谱。DP 粉末、纯 DP 管和含 IGF-1 管的相应光谱看起来非常相似；在 1720 cm⁻¹ 处有 C=O 双键的突出峰，在 1150 cm⁻¹ 处有 C-O 单键的突出峰，导致 C=O 与 C-O 强度的比率相似（图 S1）。相比之下，PEG 中的 C-O 单键波数低于 DP，为 1070 cm⁻¹。由于 DP 在 900–1250 cm⁻¹ 范围内有许多谱带，因此不能得出结论，认为源自残留 PEG 的 C-O 键由于与其他谱带重叠而在 DP 样品中可见。
图4. 含 IGF-1 管和纯 DP 管的 FTIR 评估（n=4），在 y 轴上作为展示内容分布。对于 DP 和 DP-IGF-1 管的静电纺丝，首先产生 PEG 层，从金属棒上移除时溶解；添加 PEG 的光谱用于比较（A）。每个单管的 FTIR 光谱，见图 S2。DP 管的 FTIR 评估，包括相应的波数和化学键，最突出的峰用红色突出显示（B）。
此外，静态水接触角（WCA）的评估显示，含 IGF-1 的静电纺纤维网的 WCA 明显低于纯 DP 网（图 5），表明乳液静电纺网比纯 DP 网更亲水。此外，分别从 DP 管、DP-IGF-1 管和 PEG 获取了 DSC 光谱。可以观察到，含 DP 和 IGF-1 的管的熔点为 130°C（图 6A；每个单管见图 S3），玻璃化转变点约为 - 42°C（图 6B）。PEG 在 60°C 的显著熔点反映在 DP-IGF-1 中，以及如果洗涤不完全，纯 DP 管中也会出现。与 FTIR（图 4）相比，DP 和 DP-IGF-1 管的 DSC 光谱可用于检查 PEG 是否完全去除。
图5. 纯 DP 纤维网和含 IGF-1 的乳液静电纺 DP 纤维内表面的静态水接触角（静态 WCA）（A）和动态 WCA，滞后 = 前进 WCA - 后退 WCA（B）。经测定，乳液静电纺管的 WCA 在统计学上显著低于纯 DP 管。对于静态 WCA 和动态 WCA，每个样品分别平均五次和三次测量，n=3。数据以平均值和标准差显示。静态接触角用非配对 t 检验进行比较；p≤0.0001（****）。
图6. 含 IGF-1 管和纯 DP 管的 DSC 评估（A），带有玻璃化转变区域的细节（B）。为了比较，显示了 PEG 的 DSC。注意，在 A 中，各个线条在 y 轴上以 1 的间隔分布作为展示方式，而在 B 中，显示了直接比较。
️04. 释放动力学
对新鲜生产的三层管在不同兔血清白蛋白（RSA）浓度下的释放动力学进行了评估。RSA 用作载体蛋白。在两个纯 DP 层之间，分别用 0.1%、0.25% 和 0.5% 的 RSA 生产了一层 IGF-1 乳液静电纺层。图 7A 表明，0.25% RSA 释放的 IGF-1 量最高，而中间层中 IGF-1 的保留在 0.1% RSA 时最显著，0.5% 时的释放量介于两者之间。与 0.1% RSA 相比，0.5% RSA 时静电纺网的密度较低（图 S4）。
图7. 三层管中 IGF-1 的累积释放动力学作为大鼠血清白蛋白（RSA）的函数（A-C）和两层管评估的不同储存条件（D-F）；单位为 ng/mL（A，D），支架的 ng/cm²（B，E）和总负载的 %（C，F）。注意，尽管三层管中 IGF-1 的释放量较低，但方式更可控，而两层管中 IGF-1 表现出突释。然而，为了比较储存条件，清楚地表明，就释放的生长因子量而言，无储存即新鲜生产的样品最佳，而在室温下储存 10 个月释放的 IGF-1 量最低。给出了每个管的示意图；纯 DP 层用灰色表示，IGF-1 层用黑色表示。0.004 天等于 1 小时。数据以平均值和标准差显示。IGF-1 长达 42 天的累积释放曲线，请见图 S5。
此外，对两层管（一层含 IGF-1（0.1% RSA），一层含纯 DP 纤维）在生产后立即（无储存）以及在室温（RT）或 - 20°C 下储存 10 个月后的释放动力学进行了评估（图 7B）。可以看出，无储存导致释放的 IGF-1 量最高，其次是在 - 20°C 下储存，而在 RT 下储存的管释放的生长因子量相对较低。
️05. IGF-1 的生物活性：I 型胶原、ki67 和腱调蛋白的基因表达
来自两只不同兔子的兔肌腱细胞中 I 型胶原的基因表达显示，从 0 到 1 ng/mL 补充 IGF-1 时表达增加，从 1 ng/mL 到 10 ng/mL 时表达减少（图 8）。在从两只兔子收获的肌腱细胞中，1 ng/mL 补充 IGF-1 与 0 ng/mL（对照）之间的差异显著，但以前掺入并释放的 1 ng/mL 浓度的 IGF-1 的 I 型胶原表达与对照无显著差异，尽管在兔子 2 中发现了 I 型胶原表达增加的趋势。对于 ki67 和腱调蛋白，与对照相比，两只兔子中释放的 IGF-1 的生物活性通过显著增加得到证实，当用补充的 IGF-1 刺激时，这两种标记物均显示出显著上调。1 ng/mL 补充的和 1 ng/mL 释放的 IGF 均诱导了大致相同的效果，验证了静电纺丝过程后蛋白质的生物活性得以维持。
图8. 掺入的 IGF-1 的生物活性。两只兔子（上下行）和三个标记物（I 型胶原、ki67 和腱调蛋白）暴露于 0、0.1、1 和 10 ng/mL 补充 IGF-1 以及暴露于从乳液静电纺网释放的 IGF-1（浓度 1 ng/mL；表示为释放 1 ng/mL）的兔跟腱肌腱细胞的基因表达；评估 3 天的细胞培养。数据以平均值和标准差显示，p 值≤0.05 被认为显著，用（）表示；p≤0.01（）；p≤0.001（）；p≤0.0001（****）。关于 IGF-1 补充对兔跟腱肌腱细胞培养物中细胞形态的影响，见图 S6。
️ 三、讨论
肌腱损伤和断裂在愈合过程中常常导致两个主要问题。一方面，由于早期康复期间的固定，与周围组织的粘连形成可能会限制活动范围，导致工作障碍并妨碍日常活动。另一方面，生物力学上较差的修复组织容易再断裂，尤其是在受伤后过早施加高负荷的情况下，由不小心或突然的动作引起。
因此，正在研究可在重建手术中轻松应用的修复装置。在这方面，一种可行的选择是一种生物活性、可生物降解、有弹性且方便外科医生使用的小管，像袖子一样用于常规缝合的肌腱上，正如我们之前对掺入 PDGF-BB 的聚合物管 DP 的报道。此类管不仅已被证明可将粘连形成减少约 20%，而且还能显著增加术后三周提取肌腱的生物力学性能。结果，至少在一定程度上可以避免再断裂。为了进一步优化此类植入材料，我们在本研究中专注于掺入生长因子 IGF-1。
生长因子 IGF-1 是一种小蛋白质，据报道可在体外支持肌腱细胞增殖、DNA 合成和蛋白质合成，尤其是 I 型胶原。除了作为单一因子应用时的这些增殖和基质刺激作用外，据报道 IGF-1 与 PDGF-BB 联合应用时具有协同作用。有报道称，100 ng/mL IGF-1 与 50 ng/mL PDGF-BB 的组合在肌腱细胞体外培养的剂量 - 反应曲线中导致最高的增殖水平。此外，据报道，100 ng/mL 的 IGF-1 与 10 ng/mL 的 bFGF 和 100 ng/mL 的 PDGF-BB 联合使用，对旨在重新填充用于肌腱修复的水凝胶的脂肪来源干细胞具有协同作用。
由于生长因子 IGF-1（7.6 kDa）比 PDGF-BB（24 kDa）小得多，我们之前的乳液静电纺丝制造方案必须进行调整。最初，我们制造了一种含 IGF-1 的 DP 双层管，类似于之前报道的 PDGF-BB 管。然而，释放动力学并不理想，因为 IGF-1 在第一小时内立即释放（突释）。因此，我们将 IGF-1 掺入新型三层管的中间层，外两层由纯 DP 组成，类似于三明治结构，而 IGF-1 层通过油包水乳液的乳液静电纺丝制造，其中 IGF-1 水溶液在 DP（溶解于有机溶剂中）中。对于释放，IGF-1 需要覆盖的距离更长。经过这一优化步骤，释放动力学结果显示出在数天内更持久、持续的模式（图 7）。
此类静电纺网的 SEM 图像显示，面向目标的表面光滑，外部为沟槽表面（图 1），导致观察到的各向异性力学（图 3）。然而，当比较内表面和外表面时，SEM 成像未显示纤维直径的大差异（图 2），纯纤维和含 IGF-1 纤维的直径分别约为 5 μm。其他静电纺网，如细胞相容且可生物降解的纤维状伤口敷料，也有类似的纤维厚度报道。较大的标准偏差源于纤维厚度的高可变性。然而，与纯 DP 管相比，IGF-1 乳液静电纺管在外表面的纤维厚度显著较低。由于纯 DP 和 IGF-1 管的制造过程中电压和流速保持恒定，乳液静电纺纤维的较小纤维直径必须归因于聚合物溶液表面张力和粘度的变化。与纯 DP 溶液相比，油包水乳液的聚合物射流稳定性较差，更容易提前分裂，导致目标上的纤维厚度较小，正如这里所观察到的。这些发现与其他乳液静电纺丝研究一致，例如，在水相中添加牛血清白蛋白会增加导电性并拉长聚合物射流，从而与纯聚合物纤维（无水相）相比产生更细的纤维。在一项油包水静电纺丝研究中，通过增加水的百分比，平均也获得了更细的纤维。
机械分析证实了静电纺管的各向异性行为，与横向相比，轴向的断裂应变、极限应力和杨氏模量更高。有趣的是，含 IGF-1 的管与纯 DP 管相比表现出显著不同的机械性能。乳液静电纺管的断裂应变显著更高，这意味着乳液静电纺纤维在拉伸时导致较低的大分子摩擦，这是由这些纤维内的微小水滴引起的（图 3D）。
与纯 DP 管相比，IGF-1 管的极限拉伸应力增加了约 1.3 倍（图 3B），
这可能是由于嵌段共聚物 DP 纤维内的水滴引发的潜在结晶过程所致。据推测，由大单元（聚羟基丁酸酯）组成的硬段可能受到水滴的影响，使水解局部产生具有不同（可能更硬）特性的较小聚合物单元。最后，与纯 DP 管相比，含 IGF-1 的管的弹性模量被发现有所增加（图 3C），这与上述极限应力显著更高的发现一致。
除了两种管之间的这些差异外，横向和轴向的力学性能也分别存在显著差异。轴向（沟槽平行方向）的性能结果显著更高（图 3E）。外表面的沟槽导致破坏材料所需的力增大，因为它们实际上由厚而致密的静电纺纤维组成的无孔实体构成。因此，我们发现明显的各向异性并不感到惊讶。
通过 FTIR（图 4 和图 S2）对管进行了进一步表征。正如预期的那样，纯 DP 管和含 IGF-1 的乳液静电纺管之间没有发现明显差异。在 1720 cm⁻¹ 处的 C=O 双键特征带在纯管和乳液静电纺管中均得到验证。该键是聚酯和聚氨酯的典型特征，范围在 1730–1690 cm⁻¹ 之间。DP 是一种嵌段共聚物，具有聚酯氨基甲酸酯的基本单元，最初开发用于骨组织工程。此外，DP 和 IGF-1 管在 1250–900 cm⁻¹ 范围内显示出相同的多带图案，在 1150 cm⁻¹ 处有一个突出的带，这是 C-O 单键的特征。如三个管所示（图 S2），这种静电纺管的重复制造导致相同的 FTIR 光谱。当将这些光谱与纯 PEG 的光谱进行比较时，PEG 用作第一层，然后溶解以便于将管从金属棒上分离。然而，明显不存在 1720 cm⁻¹ 处的谱带。此外，由于 C=O 键紧邻 C-O 单键（聚醚而非聚酯）的缺失，在 1250–900 cm⁻¹ 范围内的多带存在差异，这可能导致 C-O 波数与酯相比向较低值移动。脂肪族醚在 1150–1085 cm⁻¹ 范围内表现出不对称拉伸，而脂肪族酯的两个偶联不对称拉伸波数为 1210–1163 cm⁻¹。
正如预期的那样，含 IGF-1 的油包水乳液静电纺支架的静态 WCA 低于纯 DP 纤维网（图 5）。这意味着乳液静电纺网的亲水性显著更高，这归因于聚合物纤维内掺入的小水滴。因此，与纯 DP 支架相比，IGF-1 样品的动态 WCA（前进和后退）较低，尽管差异不显著。两种材料均发现较大的接触角滞后（70–80°），表明两种静电纺材料的表面均相当不均匀，这通过 SEM（图 1）得到证实。^(*￣(oo)￣)^
此外，对不同材料进行了热分析（图 6 和图 S3）。DP 管和含 IGF-1 的乳液静电纺 DP 管的 DSC 光谱看起来非常相似，熔点约为 130°C，这证实了之前对 DP 粉末（129°C）和静电纺纯 DP 网（134°C）的研究结果。相比之下，纯 PEG 的熔点为 70°C。然而，当静电纺 DP 网中存在 PEG 杂质时，熔点会略微降低至 65°C，这在此处得到证实（图 6A）。关于玻璃化转变点，DP 的玻璃化转变点约为 - 38°C。
对支架释放的 IGF-1 的体外释放动力学进行了不同配方的评估（图 7A）；早期曾用非生物活性且低分子量（荧光素，376.27 g/mol）和高分子量（FITC-BSA=FITC 标记的牛血清白蛋白，66 kDa）的模型生物分子进行过类似实验，可视为不包括生物活性对照化合物。兔血清白蛋白（RSA）被用作 IGF-1 的载体蛋白，否则 IGF-1 会被降解。鉴于未来计划进行的兔跟腱体内实验，使用了兔血清白蛋白而非 BSA。不同浓度的 RSA 导致从三层管中间层释放的 IGF-1 量不同，0.25% RSA 浓度导致释放量最高。较低浓度（0.1% RSA）导致释放量仅为 0.25% RSA 时释放量的约 20%，表明 IGF-1 的稳定化不足。另一方面，乳液水相中的 0.50% RSA 浓度导致纤维内的稳定化和保留过强，无法理想地释放生长因子，生长因子保留在纤维内。在任何 RSA 浓度下，大部分 IGF-1 在一天内释放，随后持续释放至第 4 天。然而，体内应用将具有不同的释放动力学，因为伤口床中的酶的复杂情况会加速 DP 降解，因此以不同的时间依赖方式释放更多 IGF-1。早期含 PDGF-BB 的 DP 支架的脂肪酶降解已例证了这一点。
此外，由于生物活性管设想用于临床，因此评估了储存温度的影响（图 7B）。掺入两层管一层中的 IGF-1 的释放动力学表明，新鲜条件（即静电纺丝后立即）导致释放的生长因子量最高。然而，如储存 10 个月所示，将支架储存在 - 20°C 比在室温（RT）下更好。另一项研究评估并报道了储存条件的影响，其中抗坏血酸掺入 DP 纤维网中。然而，这些样品仅储存了 1 周。尽管如此，发现了类似的趋势，即新鲜样品释放的抗坏血酸量最高，并且随着储存温度按 RT、4°C 和 - 20°C 的顺序降低，释放量减少。
据报道，在马肌腱细胞培养物中，IGF-1 浓度为 10 和 100 ng/mL 时，I 型胶原的基因表达增加 2-3 倍。其他报道发现，在相同的 IGF-1 浓度下，IGF-1 对大鼠尾肌腱细胞培养物中 I 型胶原表达的影响可忽略不计。在我们的兔跟腱肌腱细胞 3 天培养中，补充 IGF-1 后，我们发现 I 型胶原基因表达在 0、0.1 和 1 ng/mL 时呈剂量依赖性增加，在 10 ng/mL IGF-1 时下降（图 8）。因此，测试了 1 ng/mL 释放的 IGF-1 的生物活性。然而，释放的 IGF-1 在三天后未诱导 I 型胶原基因表达的显著增加，尽管在两只兔供体中的一只中，与对照相比有 I 型胶原表达更高的趋势。
然而，生长因子 IGF-1 的生物活性保留可以通过 ki67 和典型肌腱标记基因腱调蛋白的基因表达来证明。对于这两个标记物，以及从两只不同兔子的兔跟腱分离的肌腱细胞，释放的 IGF-1 蛋白与新鲜添加的 IGF-1 具有非常相似的影响（基因表达显著高于对照）（无 IGF-1）（图 8）。尽管在这里使用的 IGF-1 浓度高于本研究中的浓度，研究人员也报道了大鼠肌腱细胞培养 3 天后腱调蛋白表达增加。因此，我们的发现与文献报道一致，并证实了静电纺丝过程后 IGF-1 的生物活性得以维持。
最后，在第 3 天用不同浓度的 IGF-1 进行的细胞培养实验显示，在 10 ng/mL IGF-1 时细胞形态发生显著变化（图 S6）。与补充 PDGF-BB 的发现非常相似，在 IGF-1 补充下，细胞表现出较小的长宽比。细胞骨架的这种重组可归因于 PI3K/Akt 信号通路的激活，因为 PDGF-BB 和 IGF-1 均通过与它们各自的受体 PDGFR 和 IGF1R 结合引起 Akt 的磷酸化。
尽管本文的重点在于掺入 IGF-1 蛋白以支持肌腱断裂修复的新型乳液静电纺植入材料的制造和表征，但仍存在一些局限性。首先，这里缺少细胞 - 材料相互作用，这可以深入了解 IGF-1 对细胞粘附的影响，尤其是用 F - 肌动蛋白和 vinculin 染色来表征粘着斑形成。此外，IGF-1 释放对接种细胞产生的细胞形态变化可能令人感兴趣，并可与在细胞培养板中获得的结果进行比较（图 S6）。其次，必须在临床前动物模型中对这些植入材料进行体内评估，以评估它们的适用性及其对组织再生的影响。
️ 四、材料和方法
️01. 聚合物 DegraPol
DP 的合成方法如下：将 25 wt% 的聚（3-（R - 羟基丁酸酯）- 共 -（ε- 己内酯）- 二醇（Mn=2824 g・mol⁻¹）与 75 wt% 的聚（ε- 己内酯）- 二醇 - 共 - 乙交酯（15 mol% 乙交酯，85 mol% ε- 己内酯）（Mn=1000 g・mol⁻¹）溶解于 1,4 - 二氧六环中，干燥至水含量低于 20 ppm。冷却溶液后，加入化学计量的 2,2,4 - 三甲基己烷二异氰酸酯（TMDI）。1 天后，在 1 天内分三次加入二月桂酸二丁基锡（20 ppm），以获得 100–110 kDa 的分子量。聚合物经冷却的己烷异构体沉淀后，用氯仿和硅胶 60 柱（Fluka）纯化，最后在冷却的乙醇中沉淀。
️02. 生长因子 IGF-1 的掺入
溶液在静电纺丝前 1–3 天制备。每个支架均需制备聚乙二醇（PEG）（35 kDa，#81310）溶液：将 1.5 g PEG 与 3.5 g 氯仿（#132950）混合。DP 溶液的制备方法为：将 0.6 g DP 粉末、3.52 g 氯仿与 0.88 g 1,1,1,3,3,3 - 六氟 - 2 - 丙醇（HFP，#105228）加入带螺帽的玻璃瓶中。为掺入重组人 IGF-1（#100-11-100UG），将 4 µg IGF-1 溶解于 400 µL 含兔血清白蛋白（RSA）的磷酸盐缓冲溶液（PBS，#3-05F39-I）中（PBS 中 IGF-1 浓度为 10 µg/mL，RSA 浓度为 0.25%），逐滴加入 DP 溶液，同时在磁力搅拌器上以 500 rpm 搅拌 5 分钟。溶液经涡旋短暂混合后，在超声波浴中乳化 15 分钟。乳化液装入 5 mL 玻璃注射器（#3.7102.33），立即用于静电纺丝。由于该油包水乳液掺入 IGF-1 的方案与先前掺入 PDGF-BB 的方案相同，可假设含 IGF-1 的水滴在 DP 纤维内均匀分布。
️03. 静电纺丝
静电纺丝装置为自制设备，包括直流高压电源、针头支架、输送器和注射泵（SP210cZ）。带钝端的纺丝头使用不锈钢针头（内径 1 mm，壁厚 0.3 mm）。将长度 55 cm 的金属棒安装于旋转电机（Euro Star B rotary motor）上作为收集器。管制备的静电纺丝条件为：流速 1 mL/h，纺丝针头与金属棒间距 9.5 cm，电压 12.5 kV，收集器转速 500 rpm。室温恒定在 22–23°C，湿度 25–35%。输送 DP 溶液的针头在 20 cm 范围内往返移动。首先在金属棒上沉积 PEG 层以便于剥离 DP 管，随后将 DP 或含 IGF-1 的 DP 层静电纺于 PEG 层上。用 50% 乙醇剥离后，将管储存于干燥器中。
️04. 静电纺网中 IGF-1 的释放动力学
取三个直径 0.2 cm、长度 0.5 cm 的管样品，分别置于低结合微管（#022431064）中，加入 500 µL 含 0.1% RSA 的 PBS 作为释放介质，于 37°C、300 rpm 振荡孵育。各时间点收集培养基至标记的离心管中，并补充新培养基。释放样品储存于 - 20°C 直至检测。IGF-1 释放量通过人 ELISA 试剂盒（ab108873）按说明书测定，使用 ELISA 微孔板读取器（Cytation/5 imagine reader）在 450 nm 波长（570 nm 校正）下检测。数据以累积释放量（ng/mL）表示。孵育后，支架储存于残留 PBS 溶液中，-20°C 保存。
️05. 肌腱细胞培养和实时 PCR
使用从兔跟腱分离的肌腱细胞，解冻后重悬于培养基中（Ham's F12（#L0135-500）含 10% FBS（#S1830-500）、1% 青霉素 / 链霉素（#P4333-100ML）和 1% 谷氨酰胺（#35050-038））。使用第 2–3 代（P2–P3）细胞，测试培养基中补充 0、0.1、1、10 ng/mL 重组人 IGF-1 及释放的 1 ng/mL IGF-1 的影响。
将兔肌腱细胞以 2×10⁵细胞 / 孔的密度接种于六孔板（#SIAL0516，每孔面积 9.6 cm²），加 2 mL 培养基孵育过夜。第 0 天加入相应浓度 IGF-1，于 37°C、5% CO₂培养 3 天后收集细胞并拍照记录形态。使用两个供体的细胞，qPCR 重复三次。总 RNA 提取采用 RNeasy Plus Mini Kit（#74104），经无 RNase 的 DNase 处理（#74104），通过 Nanodrop One 测定 RNA 纯度和浓度。逆转录（RT）反应体系为 20 µL，含 500 ng RNA（SuperScript III 逆转录酶，#18080085；Oligo (dT) 12-18 引物，#18418012；RNase 抑制剂，#N8080119；dNTP，#18427013），通过紧凑型热循环仪完成。实时 PCR 反应使用 4 µL cDNA（稀释 10 倍）、Quant Studio 5 和 Fast SYBR Green Master Mix（#4385612），技术重复三次。反应条件：95°C 预变性 3 分钟，40 个循环（95°C 3 秒，60°C 20 秒）。兔引物由 Microsynth 合成（表 S1），采用 2−∆∆CT 法分析相对表达，以 18S 为内参基因，结果以相对于无 IGF-1 对照的倍数变化表示（标准化为 1）。
️06. 扫描电子显微镜（SEM）
制备样品以观察静电纺网的内表面、外表面和横截面，用导电双面胶带固定于 SEM 载体，通过溅射涂层仪（Safematic CCU-010）镀 10 nm 铂膜。使用 SEM（Zeiss Gemini SEM 450）在 5 kV 电压下观察，以 507× 放大倍数、49% 亮度拍摄照片，检测器设为二次电子模式。使用 ImageJ（1.53e/Java 1.8.0_172）测量纤维直径和管壁厚度，采用时钟刻度法标准化壁厚测量，于 2、4、6、8、10、12 点位置拍摄 SEM 照片，每图随机测量 3 次，对角线法测量所有交叉纤维。
️07. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）
使用配备 Golden Gate - 金刚石 ATR（带温度控制）的 Varian 640 FTIR 光谱仪，扫描范围 600–4000 cm⁻¹，分辨率 4 cm⁻¹，64 次扫描累加。计算 1720 cm⁻¹ 处 C=O 峰与 1175 cm⁻¹ 处 C–O 峰的强度比，数据归一化至 C=O 峰（1720 cm⁻¹）。检测 DP 粉末、纯 DP 管、乳液 DP 管及 PEG，通过与 IR 光谱表（Merck KGaA）对比确定特征官能团。
️08. 差示扫描量热法（DSC）
采用 DSC2500（TA Instruments）进行热分析，样品重量 3–15 mg，扫描范围 - 90°C 至 170°C，升降温速率 10°C/min，记录两次加热和一次中间冷却循环。通过 TA Instruments TRIOS 软件计算玻璃化转变温度和相变焓，仅采用第二次加热循环数据。检测 DP 粉末、纯 DP 管、乳液 DP 管及纯 PEG，以检查 PEG 残留。
️09. 静态和动态水接触角
使用 OCA 35 光学接触角测量仪（Dataphysics）测量纯 DP 和含 IGF-1 的乳液静电纺网的水接触角（WCA）。静态接触角：5 µL 水滴，测量左右接触角并取平均值，每样品测 5 次。动态接触角：通过添加 / 移除水滴测量前进角和后退角，接触角滞后 = 前进角 - 后退角，每样品记录视频并通过 ImageJ 测量左右角度，取 3 次平均值（n=3）。
️10. 机械性能
使用 Zwick Z010 单轴载荷试验机（20N 载荷传感器）测量纯 DP 和含 IGF-1 乳液 DP 管的应力 - 应变曲线。轴向和横向性能通过切割 2 mm×18 mm 矩形试样（源自 6 mm 管径）进行测试，夹持长度 10 mm；管状样品切割为 2 mm 片段，夹持长度 8 mm。施加应变速率 10 mm/min 直至断裂，记录应变（%）、拉力（N）、试样宽度（mm）和层厚度（mm），计算断裂应变（%）、极限拉伸应力（MPa）和杨氏模量（MPa）（n=6）。
️11. 统计学分析
使用 GraphPad Prism 9 进行数据分析，Shapiro-Wilk 检验验证数据正态性。两组间比较：正态分布数据采用非配对 t 检验，非正态分布采用 Wilcoxon 检验。多组间比较：正态分布数据采用单因素方差分析（ANOVA，Tukey 多重比较），非正态分布采用非参数 Kruskal-Wallis 检验。p≤0.05 为显著，标记为 (*）；p≤0.01（**）；p≤0.001（***）；p≤0.0001（****）；ns 为非显著。标准曲线和其他计算通过 Excel（2016）完成。
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