IF：7.7，14种细胞死亡模式+单细胞+免疫治疗，万能套路，一键复刻！
️题目：骨肉瘤中多种程序性细胞死亡相关预后基因的整合分析和凋亡相关基因的功能验证
️英文名：Integrated analysis of multiple programmed cell death-related prognostic genes and functional validation of apoptosis-related genes in osteosarcoma
️杂志：International Journal of Biological Macromolecules
️影响因子：7.7
️发表时间：2025年3月13日
️研究背景：骨肉瘤（OS）是一种预后较差的恶性骨肿瘤，传统治疗对转移性/复发性患者效果有限。程序性细胞死亡（PCD）模式影响肿瘤进展和治疗反应，但单一PCD类型的研究无法全面反映OS异质性，亟需整合多模式PCD基因构建预后模型并探索靶向治疗。
️研究思路：本研究通过从TARGET-OS和GEO数据库中获取转录组、单细胞转录组和临床信息，并分析14种细胞死亡模式的基因，建立细胞死亡指数（CDI）签名。基于CDI计算的七种基因与转移相结合，构建了一个列线图模型来有效预测骨肉瘤患者的预后。通过免疫组化验证了CDI模型中的核心基因GALNT14与不良生存的相关性，并研究了GALNT14的缺失对骨肉瘤进展和细胞增殖的影响。研究还探讨了靶向GALNT14的药物Bortezomib如何提高化疗敏感性，并阐明了其作用机制。
️研究结果：
️1、骨肉瘤中细胞死亡簇的鉴定
为探究不同细胞死亡途径对骨肉瘤（OS）患者预后的影响，使用基因集变异分析（GSVA）计算14种细胞死亡模式的评分，发现多种细胞死亡途径间存在显著相关性（图2A）。单因素Cox回归分析显示，免疫原性细胞死亡、Parthanatos、Entotic细胞死亡、溶酶体依赖性细胞死亡、坏死性凋亡和焦亡与OS预后显著相关（图2B）。通过对14种细胞死亡评分进行无监督共识聚类分析，结合累积分布函数（CDF）值及曲线（图2C），确定聚类指数‘k’=2时最佳，进而鉴定出两种细胞死亡簇：簇1（C1）和簇2（C2），分别包含39和46个样本（图2D）。模糊聚类比例（图2E）和主成分分析（PCA，图2F）验证了聚类结果的稳定性和两簇间的分离。Kaplan-Meier分析表明C1预后显著较差（图2G），复发率更高（图2H）。除网络细胞死亡、氧化凋亡和铜死亡外，其余11种细胞死亡评分在各簇间存在显著差异（图2I），且簇间临床参数也存在显著差异，C1特征为多种细胞死亡途径水平升高且死亡率更高（图2J）。
图1
️2、不同细胞死亡簇的免疫状态和功能分析
为了阐明每个簇的免疫反应，探讨了细胞死亡簇之间的免疫差异。结果显示，与C2相比，C1的基质和免疫评分显著较低，肿瘤纯度显著较高，总体生存率较差（图3A）。
C1显示出各种免疫细胞类型（包括T细胞、B细胞和NK细胞）的浸润显著低于C2（图3B）。CIBERSORT分析揭示了不同的巨噬细胞极化模式，与C1相比，C2的M1和M2巨噬细胞比例更高，M0巨噬细胞比例更低（图3C），基因集变异分析（GSVA）发现，C2中炎症信号通路显著富集，包括通过NFκB的TNFα信号传导、缺氧、IL-6/JAK/STAT3信号传导和凋亡（图3D）。基因集富集分析（GSEA）进一步支持了这些发现，揭示了与炎症相关的通路富集，如精子发生、补体、凋亡、IL-6信号传导和IL-2/STAT5信号传导（图3E）。
图2
️3、细胞死亡指数的构建
为了进一步研究两个簇之间的基因变异，进行了簇间差异表达分析。共鉴定出56个差异表达基因（DEGs）（图4A）。进行了这些DEGs的GO、KEGG通路分析（图4B,C）。总之，结果表明，PCD基因表达与免疫反应、炎症反应和癌症相关通路的调节有关。
为了构建稳健的预后模型，基于DEGs的两个亚组通过单因素Cox回归分析鉴定出51个预后相关基因（图4D）。随后，使用LASSO Cox回归分析得出一个包含7个基因的特征，包括ACTA2、GALNT14、F13A1、MS4A4A、EVI2B、GRN和SELPLG（图4E-G）。CDI分组和患者生存状态的散点图以及Kaplan-Meier生存分析表明，高CDI组患者的预后显著较差（图4H,I）。时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，CDI具有强大的预测准确性，1年、3年和5年的曲线下面积（AUC）值分别为0.817、0.810和0.837（图4J）。这些发现表明，CDI是OS的有价值的预后生物标志物。
图3
️4、CDI特征的外部验证及其与免疫治疗反应的关联
为了进一步验证CDI的预后效用，使用GSE21257和GSE39055数据集进行了外部验证（图5A,B）。CDI在这些独立队列中对总生存期具有强大的预测能力。CDI评分较高的患者更有可能发生复发和转移，且总生存期较差（图5C,D）。CDI在C指数方面始终优于这些模型（图5E）。分析了CDI与免疫细胞浸润程度的相关性，发现17种免疫细胞与风险评分显著相关（图5F）。此外，分析了27种免疫检查点的表达水平与风险评分的相关性。该分析表明，风险评分与13种免疫检查点的表达水平显著相关（图5F）。因此，CDI特征可能是代表抗肿瘤免疫状态和预测免疫检查点抑制剂治疗反应的潜在标志物。
图4
️5、基于临床特征和CDI的列线图的建立与评估
单因素和多因素Cox回归分析结果表明，CDI和转移状态是总生存期的重要预测因子（图6A,B）,构建了一个包含CDI评分和转移状态的列线图，其C指数为0.840，显示出优异的预测性能（图6C）。校准图证实了列线图在预测1年、3年和5年总生存率方面的准确性（图6D）。Kaplan-Meier生存分析和时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线分析进一步验证了列线图的预后价值（图6E,F）。这些发现表明，所开发的列线图是预测OS患者预后的有价值工具，可能有助于临床决策。
图5
️6、单细胞转录分析和特征基因的验证
分析OS单细胞RNA测序数据集GSE162454，该数据集包含28个细胞簇和8种不同细胞类型（图7A-C）。通过RT-qPCR在不同细胞系中分析CDI模型中7个基因的mRNA表达水平，发现所有7个基因在OS细胞中均有表达，其中6种OS细胞系的GALNT14表达水平通常高于成骨细胞系（hFOB1.19）（图7D）。在7个基因中，GALNT14是最具影响力的促癌基因。生存分析显示，高GALNT14组生存时间更短（图7E）。将OS患者组织样本分为低风险组和高风险组后，免疫组织化学染色表明高风险患者组GALNT14蛋白表达水平显著更高（图7F），这一系列结果表明GALNT14在高侵袭性OS细胞系和高风险OS患者中高表达。
图6
️7、 GALNT14缺失通过促进体外凋亡和抑制体内OS细胞增殖显著抑制OS进展
为探究GALNT14在骨肉瘤（OS）进展中的作用，将阴性对照或siRNA（si-NT14–1、si-NT14–2和si-NT14–3）瞬时转染到U2OS和Saos-2细胞系中。RT-qPCR和Westernblotting结果显示，si-NT14–1和si-NT14–2显著敲低了细胞中GALNT14的表达（图8A、8B）。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和克隆形成试验（图8C、8D）表明，GALNT14缺失减弱了U2OS和Saos-2细胞的增殖能力。Transwell和伤口愈合试验（图8E-8G）证实，敲低GALNT14后，细胞的侵袭和迁移能力下降，表明敲低GALNT14表达在体外对OS进展产生负面影响。体内实验方面，sh-NT14组的肿瘤生长速率（体积和重量）显著低于sh-NC组（P<0.01，图8H-8J），在MG63和Hos细胞中也观察到类似结果（图8K）。MitotrackerRed试验显示，GALNT14敲低降低了OS细胞的线粒体膜电位（图8L）；DCFH-DA探针检测发现，敲低后细胞内ROS水平升高（图8M）；Lyso-TrackerRed检测表明，GALNT14敲低降低了细胞的溶酶体荧光强度（图8N）。此外，GALNT14敲低的OS细胞中，裂解的半胱天冬酶3和裂解的PARP蛋白水平升高（图8O），TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示凋亡率更高（图8P）。综上，GALNT14敲低可促进OS细胞凋亡，抑制体内OS细胞增殖，显著抑制OS进展。
图7
️8、硼替佐米通过降低GALNT14表达抑制增殖、迁移和侵袭
为探究GALNT14的小分子抑制剂，经文献筛选，发现硼替佐米（BTZ）可能是潜在抑制剂。经分子对接分析和细胞热转移试验（图9A、9B），证实BTZ能直接结合GALNT14且结合亲和力较强。体外实验中，克隆形成试验（图9D）、伤口愈合试验和Transwell试验（图9E、9F）表明，BTZ抑制了Saos-2细胞的增殖能力，阻碍了U2OS和Saos-2细胞的迁移和侵袭。CCK-8和集落形成实验显示，BTZ与顺铂、洛铂和阿霉素联合治疗，协同抑制了U2OS和Saos-2细胞的增殖。同时，BTZ处理后的细胞，线粒体膜电位、半胱天冬酶-3活性、细胞内ROS水平以及溶酶体完整性和活性的变化与GALNT14敲低效果一致（图9I-9K），且诱导了更高的凋亡率（图9L、9M）。体内实验将Saos-2细胞皮下移植到BALB/c裸鼠体内，用生理盐水、1mg/kgBTZ或1mg/kgBTZ+3mg/kg顺铂联合治疗小鼠（图9N）。结果显示，BTZ治疗组小鼠肿瘤生长缓慢，顺铂与BTZ联合治疗进一步降低了肿瘤的重量和体积（图9O-9Q），表明BTZ通过增加细胞凋亡敏感性来抑制增殖，顺铂与BTZ联合治疗在体内显著抑制肿瘤生长，BTZ介导的细胞凋亡增强了化疗敏感性。
图8
️9、硼替佐米（BTZ）通过抑制GALNT14的表达减少MT2A的糖基化以提高其稳定性，并促进细胞凋亡
O-糖基化起始酶GALNT14可调节肿瘤发展和凋亡敏感性，假设其通过下游蛋白质糖基化修饰影响OS细胞凋亡。利用凝集素微阵列检测发现，GALNT14敲低或BTZ处理后，U2OS细胞中多种糖型表达降低，尤其是大豆凝集素（SBA）和野豌豆凝集素（VVA）识别的糖型（图10A）。层次聚类分析热图及WB结果进一步证实，BTZ通过抑制GALNT14表达促进OS细胞凋亡（图10B-F）。研究发现金属硫蛋白2A（MT2A）是GALNT14介导的O-糖基化候选底物（图10G-I）。BTZ处理会因降低GALNT14表达，减少VVA介导下拉捕获的MT2A（图10J）。敲低GALNT14或用BTZ处理均增加内源性MT2A表达，提高其稳定性，延长半衰期（图10K-O）。MT2A过表达抑制骨肉瘤细胞增殖，提高凋亡率（图10P-R），敲低GALNT14同时过表达MT2A，细胞凋亡进一步增强（图10S）。
图9
总结：本研究整合多模式PCD基因构建了OS预后模型（CDI）和列线图，发现GALNT14通过糖基化修饰MT2A促进OS进展，靶向药物BTZ可抑制GALNT14并增强化疗敏感性，为OS精准治疗提供了新方向。傲星生物深耕生信分析十余载，有丰富的实验方案、完善的下游验证、机制研究服务，一对一专属服务为您排忧解难，助您轻松应对毕业和晋升！
