量子点 | 线粒体靶向的硫辛酸-Ag2S QDs实现NIR-II荧光光声成像和肿瘤的化疗光热治疗

️本文要点：亚细胞靶向治疗近年已成为癌症治疗的重要策略，而线粒体被认为是癌症治疗的潜在靶点。同时硫化银量子点（Ag2S QDs）在近红外荧光与光声成像及光热治疗领域展现出卓越性能。因此，开发具有线粒体靶向能力的Ag2S QDs具有重要意义。利用硫辛酸（一种参与细胞呼吸的酶促底物）作为配体和线粒体靶向分子的特性，本研究开发了一种简易合成水相Ag2S QDs方法。该量子点具有优异水溶性和生物相容性，可一步制备并作为线粒体靶向诊疗一体化材料。通过吸附阿霉素（DOX），研究者成功构建了名为Ag2S-DOX的多功能纳米探针。体外与体内实验表明，Ag2S-DOX适用于荧光与光声双模成像，并实现线粒体靶向化疗-光热协同治疗，为肿瘤治疗提供了创新方案。

方案1. 线粒体靶向Ag2S-DOX的制备工艺及其在PAI/FI双模式显像和肿瘤化疗光热联合治疗中的应用

本研究通过多种实验手段首次验证了一步法制备Ag2S QDs在水溶性、稳定性和粒径均一性方面的可靠性。透射电子显微镜（TEM）结果显示合成的Ag2S QDs具有良好分散性和均一性（图1A），其平均粒径约为5.85 nm。高分辨TEM图像显示约0.283 nm的晶格间距（图1B），证实所制备QDs为Ag2S纳米晶体。元素分布图谱显示纳米探针中存在Ag和S元素（图1C-F），进一步佐证Ag2S QDs的成功合成。C的1s谱图在284.4、285和288.5 eV处显示特征峰，分别对应C-C单键、C=C双键及C-S键（图1G）。Ag 3d能谱呈现367.8 eV（3d5/2）和373.8 eV（3d3/2）两个特征峰（图1H），而S的2p谱图在161、161.9、162.8和163.3 eV处的四个峰与文献报道一致（图1I），确认Ag为+1价态、S为-2价态，表明游离硫辛酸（LA）修饰的Ag2S QDs成功制备。该Ag2S QDs在近红外区域具有显著吸收，并于808 nm近红外光激发下在1120 nm处产生强烈荧光发射峰（图1J），充分展现其在深层组织成像中的应用潜力。

图1. Ag2S QDs的表征

Ag2S QDs红外谱图中2930 cm⁻¹处的羧酸特征峰，证实LA已成功修饰于QDs表面（图1K）。Ag2S QDs的水合直径分布在9-16 nm范围内（图1L），表面电荷为-43.67±0.46 mV，且循环过程中保持稳定（图1M）。在25℃条件下储存30天后，其粒径与Zeta电位仍保持稳定，表明QDs具有优异稳定性（图1N）。实验表明，荧光与光声强度随QDs浓度增加而增强，证实纳米探针具备良好成像性能（图1O,P）。荧光与光声信号强度均与浓度呈正相关。

图2. Ag2S QDs的光热性能表征

光热性能测试中，当Ag2S QDs浓度为1 mg/mL时，在1.5 W/cm²激光照射5分钟后温度升至61.4℃。相同浓度下，功率密度越高，QDs升温越显著（图2A,B）；而相同功率密度下，温度升幅随QDs浓度增加而增大（图2C,D）。多次激光循环照射实验表明Ag2S QDs具有优异光热稳定性（图2E）。经计算光热转换效率达48.94%。实验证实所制备的Ag2S QDs具备优异光热性能，可应用于肿瘤光热治疗。

图3. 1 mg Ag2S量子点对不同质量DOX的载药效率和包封率，n=3

材料往往处于最低能量状态。表面能越高，这种趋势越强。该趋势使得Ag2S量子点具有强吸附能力。利用Ag2S量子点的高比表面积吸附阿霉素（DOX），形成载药纳米探针（Ag2S-DOX）。将不同质量的DOX与1 mg Ag2S量子点加入1 mL PBS溶液中发现，载药量随DOX质量增加逐渐升高，而包封效率逐渐降低（图3A）。Ag2S-DOX的荧光光谱中出现DOX的特征发射峰，证明DOX已成功负载于Ag2S量子点（图3B）。定量实验可为DOX释放的可控性提供更具说服力的研究结果。当pH=5.4时，72小时内的DOX释放效率达59.03%±1.70%，而pH=7.4条件下仅为12.16%±2.08%（图3E）。激光照射使DOX释放速率显著提升，未辐照时释放进程则趋于平缓，经五次辐照后DOX累计释放率达52.21%±0.77%（图3F）。

图4. Ag2S QDs体外实验

纳米探针的低毒性及良好生物安全性对其临床应用至关重要。采用CCK-8试剂盒检测不同浓度纳米探针（0、15.6、31.3、62.5、125、250、500 μg/mL）对细胞生长的影响。当探针浓度达500 μg/mL时，各组细胞存活率仍高于85%（图4A），表明Ag2S量子点具有低细胞毒性及良好生物相容性。为评估纳米探针在血液中的安全性，开展溶血实验。400 μg/mL Ag2S量子点与红细胞共孵育8小时后，溶血率仍低于3%（图4B），表明其适用于体内应用。通过检测细胞中近红外荧光（NIR FI）及光声成像（PAI）能力，证实Ag2S量子点为优异的造影剂。随着孵育时间延长，细胞内Ag2S量子点数量显著增加，NIR荧光及光声信号逐渐增强（图4C、4D），表明其可被细胞摄取并通过荧光/光声成像实时监测。采用Calcein AM/PI双染法可视化观察Ag2S量子点的光热治疗效果。未加载纳米探针的激光辐照细胞呈现绿色荧光，表明细胞活性良好；而加载探针并进行808 nm激光（1.5 W/cm²）辐照10分钟后，红色PI染色细胞数量随孵育时间增加显著上升（图4E），与光声成像结果一致，证明光热治疗效果与量子点吞噬量正相关。为避免热耐受并增强疗效，联合DOX的光热-化疗可更彻底消除肿瘤。细胞死亡率随探针浓度增加呈梯度上升（图4F），验证协同治疗优势。激光辐照后，随孵育时间延长，DOX逐渐释放至细胞核（图4G）。结合图3B不同探针荧光特征，推测图4G中红色荧光较弱是由于未释放的DOX仍被Ag2S猝灭，仅释放部分可显现荧光，验证近红外激光可精准调控细胞内DOX释放。

图5. Ag2S QDs细胞实验

通过激光共聚焦扫描显微镜成像实验验证LA的靶向能力（图5A）。鉴于Ag2S量子点无法观测荧光，实验采用FITC替代表征。FITC-Mal经LA修饰后获得线粒体靶向能力，结果显示无靶向能力的游离FITC-Mal在细胞中仅呈现微弱绿色荧光，而具有线粒体靶向能力的FITC-LA可进入细胞，其绿色荧光与线粒体特异性染料的红色荧光几乎完全重叠（合并后呈黄色），证实LA具有优异的线粒体靶向能力。通过透射电镜观察细胞超薄切片可清晰看到Ag2S量子点在线粒体中特异性富集（图5B），红色方框区域为线粒体嵴结构，进一步佐证其靶向能力。图5C、D分别为不同处理后不同细胞的存活率。结果显示光热治疗联合DOX给药组的细胞存活率最低，证明联合治疗的高效性。

图6. Ag2S QDs体内成像实验

当肿瘤体积达80 mm³时启动体内成像及治疗实验。通过尾静脉注射纳米探针后，采用光声成像（PAI）与荧光成像（FI）系统对小鼠进行动态评估。体内治疗实验的成像结果显示，Ag2S量子点在肿瘤部位富集水平于注射后约12小时达到峰值，故选择此时段开展治疗并观察不同处理组小鼠的肿瘤体积、体重及相关体征变化（图6A）。实验证实，随时间推移纳米探针在肿瘤部位持续富集，12小时PA与FI信号强度达到最大值（图6B、6C），凸显Ag2S量子点优异的成像性能。值得注意的是，24小时后大部分探针已代谢清除，印证其安全性优势。通过尾静脉向荷瘤BALB/c裸鼠注射不同探针，并依据PAI/FI结果于12小时后实施治疗。热成像显示，Ag2S量子点组与Ag2S-DOX组肿瘤温度显著高于PBS组及DOX组，证实Ag2S量子点具备优良光热性能（图6D）。隔日记录的肿瘤体积显示：PBS组肿瘤增殖最快，Ag2S量子点组无明显抑制作用，而DOX组与Ag2S-DOX组可有效延缓肿瘤生长，其中Ag2S-DOX+激光组抑制效果最为显著，体现协同治疗的优越性。结合肿瘤抑制率与生存率分析，光热-化疗联合策略展现出更优疗效。然而，Ag2S量子点+激光组与Ag2S-DOX+激光组仍存在肿瘤复发（治疗14天后复发率分别为50%与25%），进一步佐证多模式联合治疗的必要性（图6F）。

各组小鼠体重在14天内无显著波动（图6G），提示其良好的生物安全性。通过ICP-MS分析Ag+含量发现，注射24小时后量子点于肿瘤部位富集量达峰值，虽与成像峰值时间（12小时）存在差异，但治疗实验表明该富集量足以产生显著疗效。此外，血液中量子点的半衰期仅为0.47小时（图6I），表明其快速代谢特性可降低潜在副作用。综合结果表明，Ag2S量子点可通过增强渗透滞留效应（EPR效应）实现肿瘤精准成像与治疗，同时兼具代谢优势。

本研究在注射后0、0.25、1、3和7天收集小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏以计算器官系数（图6J a–e）。结果显示，实验组的器官系数与对照组相比无显著变化，且均处于正常范围内。在注射纳米探针后对小鼠进行血常规、血液生化分析及主要器官组织学分析。结果显示，在注射6小时后出现变化，但7天内恢复正常（图6J f–i）。为研究注射对小鼠肝肾功能的影响，对丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）和碱性磷酸酶（ALP）进行分析。类似地，所有四项指标在注射后轻微波动，但7天内恢复至正常水平，表明Ag2S量子点未对小鼠造成显著损伤（图6J j–m）。此外，实验期间小鼠摄食正常，总体体重未出现显著变化（图6J n, o）。上述结果均证实纳米探针具有低毒性和良好的生物安全性。器官的H&E染色结果显示，对照组与实验组在注射后0.25、1、3和7天的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和小肠结构均无显著变化（图6K），表明Ag2S量子点对这些器官几乎无毒性，进一步支持其安全性。

本研究成功制备了新型线粒体靶向Ag2S量子点，其具备优异的近红外荧光（NIR FL）、光声成像（PAI）及光热性能。通过负载化疗药物构建的Ag2S-DOX复合物，可实现化疗与光热治疗的协同效应。相较于非靶向药物递送体系，线粒体靶向化疗药物在降低正常细胞毒性的同时增强了癌细胞杀伤效果，从而克服耐药性并提升疗效。然而，线粒体靶向的其他优势仍需进一步验证，例如线粒体损伤引发的细胞信号通路变化及其作用机制。总体而言，本研究开发的线粒体靶向量子点为肿瘤诊疗提供了一种具有潜力的新策略。

参考文献

Xuan Y, Su Z, Guan M, et al. Lipoic Acid Capped Ag2S Quantum Dots for Mitochondria-Targeted NIR-II Fluorescence/Photoacoustic Imaging and Chemotherapy/Photothermal Treatment of Tumors[J]. ACS Applied Nano Materials, 2025, 8(8): 3737-3748.

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