三维荧光（EEM，激发发射矩阵）原理及应用
三维荧光光谱法用于物质定性和定量检测分析（Excitation-Emission-MatrixSpectra,EEMS)是一种具有广泛应用价值的光谱指纹技术，它描述了荧光强度与激发波长和发射波长变化之间的关系图谱。它可以通过扫描监测样本中的所有成分，适用于复杂混合物的光谱表征。
有两种表现形式：一种是三维荧光立体图（三维投影图），发射光波长为x轴，激起光波长为y轴，荧光强度为z轴。一种是发射光波长为x轴，激起光波长为y轴荧光强度等高线图（等高线荧光光谱图）。
激发发射矩阵 (EEM) 是一种在荧光光谱领域越来越受重视和广泛应用的特定测量方法。EEM 本质上是一种三维扫描，可生成激发波长、发射波长和荧光强度的等值线图。
EEM 具有多种实际用途，尤其适用于多组分分析。EEM 通常被认为能够为多种样品提供分子指纹。
EEM光谱法的早期应用发表于20世纪80年代。1986年，Koller利用EEM研究了人类血清中低密度脂蛋白的色氨酸荧光；同年，Leiner也利用EEM研究了肿瘤患者血浆中的荧光成分。EEM比传统的扫描荧光计功能强大得多，因为这些传统的荧光计在三个主要方面存在局限性。
图 1.典型的激发发射矩阵 (EEM)
首先，传统的扫描荧光光谱仪无法补偿荧光分子浓度的变化。
这种现象被称为内滤效应 (IFE)，它会给传统的扫描荧光光谱仪带来问题，因为样品浓度较高时会发生吸收，导致测量的分子荧光光谱发生扭曲。这种情况通常发生在 0.1 到 0.2 个吸光度单位以上。
可以使用传统荧光计来校正 IFE，但这需要在单独的不同吸光度光谱仪上进行二次测量，然后根据需要调整测量的荧光信号。
这种校正技术不仅会增加工作量，还可能存在问题，因为测量并非同时进行，且测量体积也并非完全相同。因此，传统的扫描荧光计无法提供真正的浓度独立性，从而严重限制了传统EEM准确识别大量样品的能力。
其次，由于荧光计本质上测量的是荧光，因此它们缺乏所有非荧光分子的重要颜色和吸光度信息。这些信息对于任何多组分分子鉴定来说都至关重要。
最后，单通道扫描仪速度极慢，可能需要几分钟甚至长达一小时才能收集到完整的数据。扫描荧光计一天内实际能够收集的EEM数据量有限，因此只能处理在EEM采集期间不会发生变化或衰减的样品。
如果不进行额外的 IFE 校正，EEM 荧光的准确度仅限于吸光度值小于 0.1 至 0.2 左右的样品。为了充分利用荧光 EEM 的威力和潜力，必须使用多变量软件方法。这些方法包括经典最小二乘法 (CLS)、主成分分析 (PCA) 和平行因子分析 (PARAFAC)。
什么是内部过滤效应？
内滤效应由两个不同的过程组成。第一个是主滤光效应 (PIF)，即激发光强度在到达荧光体积之前，由于吸收作用而逐渐减弱，这与液体样品的光路长度有关。
第二种是二次滤波效应 (SIF)，即发射的荧光强度由于样品中未被激发光束直接激发的部分的重吸收而减弱。
内滤效应的光谱后果
EEM 在水质分析中的应用日益广泛，尤其是在研究有色溶解有机物 (CDOM) 方面。这类溶解有机物包括腐殖酸、氨基酸、黄腐酸以及天然水源中的其他腐烂物质。此外，它还可能包括水处理过程中产生的消毒副产物。
图2.由于测量体积外的样品吸收，蓝色激发光强度逐渐减弱。由于发射荧光的重吸收，红色发射光强度减弱。
在这里，EEM 用于突出显示这些物质在极低浓度（通常在 ppb 级）下的存在。用于此目的的仪器最好同时测量吸光度和荧光光谱。
️图3.内滤效应的光谱结果。由于荧光的重吸收，荧光光谱中较短波长的强度减弱。左侧为光密度增加的样品的荧光光谱，未经IFE校正，右侧为经IFE校正。
仅当吸光度小于约0.1至0.2时，荧光才与浓度呈线性关系。因此，对于吸光度较高的样品，必须使用紫外-可见吸收光谱进行测量和应用，以确保对荧光强度进行校正，避免内部滤光效应的影响。
️EEMS优势
与单一激发光谱或发射光谱相比，三维荧光光谱包含全面丰富的信息，可以充分描述荧光物质的图像特征，如盈光峰位置、荧光强度、盈光积分体积等，适用于复杂有机物的定性和定量分析。三维荧光光谱技术灵敏度高，选择性强，荧光信息丰富。
️EEM应用案例
1.微生物三维荧光光谱
以丁梭菌、乳酸菌和乙酸菌在0和24h的悬浮液中的原始三维荧光图为例(图3)。细菌在不同时间点的成分变化有显著差异。微生物0和24h在200～300nm之间有两个特点：盈光峰。第一个是2000～250nm(峰值在225nm周围)；第二个峰在250～300nm(峰值在275nm周围)，主要与微生物中固有的类蛋白相关，对应酪氨酸和色氨酸。荧光光谱颜色的华丽程度与荧光强度呈正相关。
微生物培养24小时后，两个特征的荧光强度显著增强。最强的峰位略向长波移动，峰宽增加。这种现象通常是微生物生长过程中细菌的大量繁殖和体内固有物质的增加。结果表明，三维荧光光谱技术可以定性地反馈不同阶段的微生物生长量，这与平板计数法和浊度比测量结果一致。
2.污水厂的溶解有机物（DOM）成分盈光的特征和来源分析
平行因素法可以解谱DOM的三维荧光谱图，充分利用盈光数据识别单个盈光成分，因此选择三维荧光光谱进行平行因素分析(PARAFAC)，通过对比分析污水厂水样荧光光谱的特点，获得1类蛋白质莹光成分和1类腐植酸莹光成分:C1(Ex/Em=245nm/340nm为色氨酸莹光峰，C2(Ex/Em=富里酸莹光峰为260nm/410nm，该污水厂含有类蛋白质和类腐殖质。
