miRNA实验干货：如何精通miRNA逆转录和荧光定量实验？

在 miRNA 的研究领域中，精准且特异性地检测和定量 miRNA 是研究的核心要点。其中，miRNA 的成功提取是后续实验得以顺利开展的基石，而 miRNA 的逆转录和荧光定量实验则是实现精准检测与定量的关键环节，其操作质量直接决定了实验结果的准确性与可靠性。如何合理选择适配的 miRNA 逆转录和荧光定量方法，一直是众多科研工作者面临的重要挑战。在本文中，我们将对这些关键技术进行深入剖析，为科研人员提供全面的理论与实践指导。

️一、miRNA 逆转录技术

miRNA 因其分子长度短小，使得常规的逆转录引物难以与其实现理想的碱基互补配对，这给 miRNA 逆转录带来了极大的困难。为克服这一障碍，对 miRNA 分子进行加长改造成为实现有效逆转录的必要步骤。当前，主要存在两种较为成熟的技术方法，即 Poly (A) 加尾法和茎环法。

在 Poly (A) 加尾法中，Poly (A) 聚合酶的活性起着决定性作用。当 Poly (A) 聚合酶具有较高活性时，它能够在较短时间内为 miRNA 添加足够长度的 Poly (A) 尾巴。这一延长的 Poly (A) 尾巴，使得 miRNA 分子可以与 Oligo (dT) 引物高效结合，为后续的逆转录反应提供基础。除 Poly (A) 聚合酶活性外，Oligo (dT) 引物的设计也是影响加尾法逆转录效率的重要因素。单纯的 Oligo (dT) 引物在与 miRNA 结合时，容易出现碱基错配现象，从而导致逆转录效率降低。为解决这一问题，在设计 Oligo (dT) 引物时添加锚定碱基，可显著增强其与 miRNA 结合的特异性和高效性，进而提升逆转录反应的整体效率。

茎环法逆转录的关键在于茎环结构的设计。理想的茎环结构需要具备与 miRNA 的 3’端特异性、高效结合的能力，同时，在逆转录过程中，该茎环结构还应能够顺利地进行折叠和打开，以确保逆转录反应的顺利进行。

从实际应用角度出发，对于需要研究多个（3个以上）miRNA 的科研人员而言，Poly (A) 加尾法逆转录试剂更为适用。这是因为利用加尾法完成一次逆转录后，可针对多个 miRNA 进行 qPCR 扩增，有效减少了实验操作的繁琐程度，提高了实验效率。而对于仅检测1 - 2个miRNA的研究者来说，茎环法因其能够产生特异性更强的逆转录结果，成为更优的选择。目前，国内生产茎环法逆转录试剂盒的企业数量相对较多，相比之下，生产加尾法逆转录试剂的企业较少。这主要是由于高效的 Poly (A) 聚合酶在生产和纯化过程中面临着一定的技术难题。目前，市面上常见的加尾法逆转录试剂品牌包括Thermo、Taraka以及BIOG百代等。

️二、miRNA qPCR 技术

miRNA qPCR 操作流程相对简便。在实验过程中，若 miRNA 提取效率较高，且逆转录过程顺利，通常能够获得较为理想的 qPCR 实验结果。

需要着重指出的是，miRNA 逆转录试剂盒和 miRNA qPCR 试剂盒通常需要配套使用。科研人员在选择实验试剂时，最好选用同一公司生产的配套逆转录试剂和 qPCR 试剂。这是因为逆转录引物上一般设计有 PCR 引物结合序列，若使用不同厂家的试剂，可能会导致 PCR 引物无法特异性地结合逆转录产物，进而造成实验失败。此外，对于初涉 miRNA 研究领域的科研人员来说，miRNA 上游引物的设计颇具难度，不仅需要耗费大量时间和精力，而且往往难以获得理想的实验结果。因此，建议选择如百代生物这类会赠送上游引物的逆转录试剂生产厂家，以降低实验难度，提高实验成功率。

随着科学技术的持续发展以及科研人员实验需求的不断增加，除了传统的两步法 miRNA 逆转录与荧光定量试剂盒外，目前市场上还出现了一步法 miRNA qPCR 检测试剂盒。使用一步法试剂盒时，miRNA 的逆转录和 qPCR 反应可在同一反应管内一步完成，无需单独进行逆转录操作，同时避免了中间开管和移液等步骤。这一技术革新极大地简化了实验流程，有效降低了实验过程中的污染风险。此外，由于一步法中 miRNA 逆转录的产物会全部用于后续扩增，使得检测灵敏度大幅提高。许多在两步法中无法检测出的 miRNA 基因，在一步法实验中能够被成功检测。因此，对于正在开展对荧光定量检测灵敏度要求较高的实验、需要对大量样品进行分析的定量 PCR 实验，或是对实验防污染要求较为严格的科研人员而言，强烈推荐选择一步法的 miRNA qPCR 检测试剂盒。目前，生产这类试剂盒的厂家数量有限，其中，BIOG 凭借其成熟的技术和丰富的研发经验，所生产的试剂盒是较为理想的选择。